Оценка жизнеспособности пивоваренных дрожжей методом подсчета дрожжевых клеток

24.01.2017

Норма засева дрожжами, как вы, наверное, слышали, очень важна для создания желаемого вкусового профиля пива. При засеве излишнего количества дрожжей пиво приобретает пресный, безжизненный вкус, в то время как недозасев приводит к выраженному вкусу алкоголя и возможному останову брожения. Обычно, если засевать дрожжи в пределах двукратной величины целевой нормы, то полученное пиво будет иметь целевые параметры.

Чтобы подсчитать соотношение живых и мертвых дрожжевых клеток с помощью гемоцитометра, вам понадобятся:

Микроскоп с 400-кратным усилением

Гемоцитометр

2 пробирки либо маленьких пузырька

Мерная пипетка объемом 2 мл

Сосуд с плотной крышкой объемом 250 мл (1 чашка) или более

Метиленовая синь (можно приобрести в зоомагазине)

Шаг 1, приготовление 0,01% исходного раствора метиленовой сини.

Не беспокойтесь, эта процедура выполняется только один раз. Чтобы отличить живые клетки от мертвых используется их окрашивание. Метиленовая синь имеет способность присоединяться к молекулам  кислот, таких, как, например, содержащаяся в клетках дрожжей дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). При этом живые клетки дрожжей способны разлагать метиленовую синь, проникшую через клеточную мембрану. В результате мертвые клетки окрасятся в синий цвет, а живые не окрасятся. Поскольку метиленовая синь токсична для клеток, ее концентрация должна быть ниже 0,1%, и после того, как дрожжевые клетки были окрашены, они должны быть подсчитаны в течение получаса. При работе с метиленовой синью помните, что, так как это очень  насыщенная  краска, то и пятна от нее очень стойкие. Если вы прольете всего лишь каплю на кухонный стол, то есть риск, что синее пятно останется навсегда. Метиленовая синь, продаваемая для очистки аквариумов, обычно имеет концентрацию 2,303%.


Для разбавления этого раствора до концентрации в 0,01% , которая рекомендуется лабораторией
White Labs:

1)                 Налейте 1 мл метиленовой сини концентрации 2,303% в сосуд емкостью 250 мл.

2)                 Залейте в сосуд 230 мл воды (230 грамм, 7,77  жидких унций, 47 чайных ложек, или одна чашка без 1 чайной ложки)

Для подсчета вам понадобится всего 0,5 мл, поэтому приготовленный раствор послужит для тестов в течении еще нескольких лет.

Шаг 2, готовим образец.

При помощи гемоцитометра вы будете исследовать только очень малую часть взвеси дрожжей, поэтому очень важно, чтобы при заборе образца взвесь была как можно более однородна. Каждый раз следует 3 раза набирать взвесь в пипетку и выпускать ее, та как на стенках пипетки остается примерно 5% от предыдущего образца. Набор взвеси в пипетку три раза гарантирует, что образец не будет разбавлен остатками предыдущего образца или воды, которой промывалась пипетка.

1) Встряхивайте сосуд с взвесью дрожжей до тех пор, пока взвесь не станет равномерно перемешанной. (Если взвесь не слишком густая, можно качественно перемешать ее при помощи специальной пластины для смешивания.)

2) Встряхивайте сосуд еще некоторое время.

3) Используя пипетку, отделите 1 мл взвеси дрожжей из сосуда. Если взвесь содержит крупные частицы, пипетка может засориться. В таком случае для отбора образца можно использовать трубочку для коктейлей.

4) Поместите 1 мл образца в одну из пробирок. Чем точнее будет выдержан объём взятого образца, тем точнее будут результаты.

5) Добавьте 19 мл воды в образец для разбавления его в отношении 20:1

6) Смещайте образец, энергично тряся пробирку, либо наберите и вылейте раствор назад с помощью пипетки около 10 раз. Набирание и выливание взвеси дрожжей через небольшое отверстие пипетки поможет раздробить большинство комочков, содержащихся в взвеси.

7) Перелейте при помощи пипетки из пробирки с образцом 0,5 мл взвеси во вторую пробирку.

8) Простерилизуйте пипетку

9) С помощью пипетки добавьте 0,5 мл 0,01% раствора метиленовой сини во вторую пробирку. Обратите внимание на то, что образец при этом дополнительно разбавляется в пропорции 2:1

Шаг 3, помещение образца в гемоцитометр.

1) Поместите гемоцитометр на бумажное полотенце и установите на место покровное стекло.

2) Перемешайте окрашенную взвесь дрожжей, набирая и выпуская ее из пипетки по крайней мере три раза.

3) Наберите в пипетку небольшое количество взвеси дрожжей (вам понадобится всего лишь 0,1 мл, меньше капли).

4) Поднесите пипетку к гемоцитометру, не касаясь его кончиком пипетки.

5) Выдавите висящую каплю и коснитесь ею точки внесения образца на гемоцитометре. Счетная камера должна заполниться до такой степени, что жидкость начнет переливаться в центральную зону перелива. Если часть жидкости начинает переливаться в боковые канавки, то это нормально, главное, чтобы они не заполнились. Если центральная зона не будет содержать в себе образца, результат окажется заниженным. Если боковые канавки будут заполнены, то результат будет завышенным.

Шаг 4, подсчет клеток.

Если у вас нет опыта использования микроскопа, то вам потребуется некоторое время для изучения ручек настройки и инструкции по правильной настройке микроскопа. Количество регулировок, имеющихся на современном микроскопе, меня лично просто удивляет, удивляет также то, насколько четким может быть изображение, если все настроено правильно. Нужно принимать во внимание гораздо больше вещей, чем одна только ручка настройки фокусировки. Когда вы рассматриваете клетки, вам необходимо отметить, как много клеток сгруппированы. Наличие кластеров, или групп клеток, указывает на то, что раствор не был перемешан должным образом, и ваш подсчет не будет репрезентативным для всей дрожжевой смеси. Сфокусируйтесь на клетках и при этом максимально закройте диафрагму. Если фокусировка слишком резкая, вокруг клеток будет виден ореол. Если фокусировка слишком слабая, то клетки будут выглядеть размытыми. Как только клетки окажутся в фокусе, открывайте диафрагму до тех пор, пока синие клетки все еще будут окрашены в синий цвет, а у неокрашенных клеток будет видна клеточная мембрана. Если диафрагма открыта слишком сильно, клетки будут выглядеть бледными, и при подсчете вы можете потерять часть из них. Фокус очень важен. Слишком резкий фокус может привести к тому, что из-за ореола мёртвые клетки будут выглядеть как живые.

1) Определите местоположение верхней левой счетной камеры (так называемый квадрат №1)

2) Подсчитайте и запишите количество живых (неокрашенных) и мертвых (синих) клеток.

3) Повторите процедуру для верхней правой, средней, нижней левой и нижней правой камер.

4) Если вы хотите оценить точность полученных данных, то можно обработать полученные данные для этих пяти квадратов методами статистического анализа.

Шаг 5, расчет.

1) жизнеспособность – процентное содержание живых клеток

v – общее число живых клеток во всех пяти квадратах.

d – общее количество мертвых клеток во всех пяти квадратах.

Жизнеспособность = v/(v+d)

Например: для v = 432 и d = 10
жизнеспособность = 432 / (432+10) = 98%

2) плотность жизнеспособных клеток – количество живых клеток на единицу объема

df = коэффициент разбавления = 20

sf = коэффициент окрашивания = 2

vol = объем квадратов, в которых ведется подсчет = 4 нл х 5 квадратов = 20 нл

cd = плотность жизнеспособных клеток в миллиардах на литр

cd = v * df * sf / vol = v * 20 * 2 / 20
cd = v * 2

например: 432 * 2 = 864 миллиарда клеток на литр

3) объем дрожжей для засева – это количество дрожжевой взвеси, нужное для достижения требуемой нормы засева
pv = объем дрожжей для засева в мл
c = количество клеток для засева в миллиардах
pv = c / cd * 1000 
пример:
c = 200 миллиардов (количество клеток, необходимых для засева)
cd = 864 миллиарда клеток на литр
pv = 200 / 864 * 1000 = 231 мл (или около 231 грамм)

По этой теме имеется изобилие доступной информации, вот несколько самых подходящих источников, которые мне встретились:

Замечательный учебник с картинками, на которых изображено то, что вы должны видеть при подсчете: http://www.whitelabs.com/beer/CellCounting&Viability.pdf

(1) Пошаговая инструкция от лаборатории
White Labs:
http://www.whitelabs.com/beer/cell_count.html

Еще несколько прекрасных поясняющих фотографий, в том числе с изображениями некоторых  вредных бактерий: http://www.whitelabs.com/beer/microscope.html

(2) В настоящее время я использую 0,03% раствор метиленовой сини, поскольку он вызываете лучшее окрашивание.

Метиленовая синь (слева), пробирки (справа), слева направо: спирт, образец дрожжевой взвеси, раствор взвеси в пропорции 20:1, окрашенный образец и вода.

Помещение образца в гемицитометр (слева), подсчет клеток (справа), живые клетки обведены зеленым. Мертвые клетки обведены красным. Синяя стрелка сверху указывает на брух. Синяя стрелка слева указывает на волокно, попавшее при очистке предметного стекла.

 

Внимание! Данная статья 18+ не рекламирует пиво или отдельно взятые пивные бренды, а носит информационно-энциклопедический характер. Чрезмерное употребление пива вредит вашему здоровью.© Полное или частичное копирование материалов без согласования с владельцами ресурса запрещено. - 2060956

Система Orphus