Эта статья представляет собой более менее серьезную попытку сопоставления информации о размножении дрожжей, которая оказалась доступна из внушающих доверие источников и собственных результатов полученных в процессе разведения культур. В финале делается попытка обобщения.

Чем полезен стартер?

Дрожжи почти всегда попадают к домашнему пивовару не в тех кондициях и не в том количестве, которое требуется для идеального брожения партии пива. В идеале, в полученной упаковке должно быть достаточно жизнеспособных клеток, чтобы обеспечить необходимую начальную норму засева, которая характеризуется количеством клеток в миллионах штук на один миллилитр сусла (млн/мл). Для эля рекомендуют засевать до 10 млн/мл, для лагера до 20 млн/мл (иногда даже 30 млн/мл) здоровых клеток. Однако я не знаю таких упаковок. Принимая во внимание это обстоятельство производители пивных дрожжей либо предлагают использовать несколько упаковок одновременно, либо приготовить стартер.

Какова степень обоснованности указанных выше цифр (10, 20 и более млн/мл)? Может быть это вовсе необязательно? Может быть пиво получиться с помощью одной упаковки дрожжей? Может быть. Но существует одно «но» — микробиологическая природа процесса брожения. Она всякий раз и диктует подобные предписания. Разберемся вкратце каким образом.

Как известно, брожение должно начинаться быстро, во избежание развития в сусле посторонних микроорганизмов — у дрожжей может оказаться достаточно конкурентов за питательные сахара сусла. Об этом написано много (в том числе и в материалах этого блога).

Отсюда следует очень простой вывод — чем дольше в сусле нет мощной популяции «культурных» дрожжей, тем выше вероятность развития контаминантов. Пивные дрожжи быстро потребляют кислород (тем быстрее, чем больше жизнеспособных клеток в пиве), выделяют углекислый газ и снижают рН сусла. В своей совокупности эти факторы — самая надежная защита пива и его безукоризненного вкуса.

Брожение должно протекать достаточно интенсивно чтобы дрожжи переработали сахара и продукты их собственной жизнедеятельности во время главного брожения и сразу после него. При этом быстро меняются различные физико-химические параметры сусла — оно превращается в пиво (именно в результате правильной деятельности дрожжей, а ничего-то иного). Стремительное изменение рН хорошая предпосылка для прозрачности пива. Дрожжи потребляют кетоны, которые сами выделяют в период роста, выделяют диоксид серы, это соединение, взаимодействуя с альдегидами, устраняет вкусы и ароматы молодого пива и активно ведет пиво к зрелости. Об этом написана специальная литература, где можно познакомится с теми или иными биохимическими процессами сколь угодно подробно. Здесь я хочу отметить еще раз — рождение вашего пива произойдет быстро и без проблем лишь при наличии достаточного количества здоровых культурных дрожжей числом порядка нескольких десятков миллионов активных клеток на миллилитр молодого пива. Этого условия в свою очередь можно добиться лишь используя указанные выше нормы засева дрожжей (ориентироваться нужно хотя бы на 10 млн/мл).

Вернемся к тому, что оказывается в руках у пивовара чаще всего. Упаковка сухих дрожжей может содержать 5-6 млрд клеток на грамм, (в 11 граммовом пакетике около 70 млрд клеток). Десять миллилитров густой суспензии жидких дрожжей от известных производителей — содержат от 60 млрд клеток (как указано производителем, правда, не на упаковке). Необходимо также иметь ввиду, что вы можете получить существенно меньше активных клеток. Это будет зависеть от сроков и условий хранения пакетов с дрожжами и может меняться в широких, часто не предсказуемых, пределах, что еще более усложняет дело. Для того чтобы обеспечить вышеприведенные нормы для 30 литров сусла нужно соответственно для эля и лагера — 300 и 600 млрд клеток. Таким образом задача стоит так чтобы увеличить число жизнеспособных клеток содержащихся в упаковке в 5-10 раз.

В литературе имеются многочисленные указания, как можно практически из одной клетки вырастить необходимое количество пригодной для брожения культуры пивных дрожжей. Рассмотрим кратко методики приведенные в различных руководствах. Приготовление стартера описывается обычно как часть общей проблемы разведения дрожжей. Однако фирмы-изготовители часто предлагают краткие указания посвященные непосредственно стартеру.

Инструкции по приготовлению стартера от производителей

На сайтах производителей дрожжей для домашнего пивоварения обычно приведены краткие указания как приготовить стартер.

Из инструкции следует, что нужно приготовить 1-2 литра (OG=1040) сусла из сухого солодового экстракта (DME) – приведены даже указания сколько нужно воды и экстракта, где и как охладить и прочее. Предлагается вылить содержимое фирменной пробирки в полученное сусло и выдержать 1-2 дня, при этом указано, что задержка начала брожения может составлять 12-24 часа. Как это часто бывает, между различными источниками информации имеются некоторые разночтения. Так в пробирке от White Labs (и других подобных, содержится 10 мл густой суспензии. В инструкции про стартер производитель пишет, что упаковка содержит от 70 до 140 млрд дрожжевых клеток. Одновременно в фундаментальном учебнике по пивоварению В. Кунце (Технология солода и пива) мы находим на странице 447 (перевод 9-го немецкого издания, издательство Профессия, С. Питербург, 2009 г): «Можно считать, что густые дрожжи содержат 3 10 ⁹ клеток/мл.», то есть 10 мл это 30 млрд клеток. Вероятно, необходимо принимать во внимание некоторые дополнительные факторы: какой дрожжевой штамм имеется ввиду, сколько конкретно и как было налито в фирменную упаковку и прочее.

Для справки, в книге «Yeast» в разделе Estimating Yeast Density находим следующую информацию. Объем пузырька White Labs составляет 47 мл. При этом заполнено в нем лишь 36 мл. После долгого пребывания пузырька в вертикальном положении дрожжи оседают и сильно уплотняются, занимая объем всего 14 мл. Если не считать жидкость поверх дрожжевой суспензии, плотность клеток в этом случае составляет очень большую величину, около 8 млрд клеток на миллилитр. Если перемешать дрожжи и жидкость в пузырьке плотность составит те самые 3 млрд/мл о которых речь шла выше. В примерах расчетов приводимых в книге часто фигурирует число 100 млрд, как примерная оценка количества клеток в упаковке White Labs.

Тем не менее нам абсолютно не важно 30 или 130 млрд клеток в пузырьке. В любом случае этого мало для трех десятков литров будущего пива. Остаются и другие вопросы. 1-2 дня это сколько? Один день или все-таки два дня? Может быть три дня? Что произойдет в этом случае? Ответов нет. Можно, конечно, почитать мнения пивоваров, оставленные на сайте, и сделать из приведенных разнообразных высказываний еще какие-то выводы. Однако остается досадное впечатление, что производитель не пожелал представить своим покупателям более подробных сведений. Другим источником информации являются статьи написанные для домашних пивоваров. Эти материалы можно обнаружить на специализированных сайтах и в соответствующих журналах. Одну из таких работ (вероятно, самую обстоятельную), мне бы хотелось рассмотреть подробнее.

Yeast Propagation and Maintenance: Principles and Practices by MB Raines-Casselman, Ph.D.

Эта статья очень информативна. В ней приведена история вопроса о размножении дрожжей, представлена сводка факторов влияющих на рост клеток, опубликованы графики иллюстрирующие результаты размножения различными методами, в том числе на магнитной мешалке, описаны методики разведения и сохранения культур. В результате у читателя появляется достаточно полное представление о предмете и многообразии различных методов решения проблемы. Правда не хватает деталей, однако, этот упрек вряд ли можно адресовать автору статьи, представляющей скорее обзор предмета, чем конкретные методические указания. Однако общее представление о методике из этой работы получить можно. Рассмотрим подробнее на чем акцентирует наше внимание Raines-Casselman.

«Развитие чистых штаммов дрожжей было поворотным пунктом, вплоть до которого все дрожжи были смесью, содержащей различные формы пивных дрожжей, диких дрожжей, бактерий, и грибов. Пивоварение с этими смесями микроорганизмов было сложным». Далее указывается, что для чистых культур «условия разведения должны быть такими, чтобы произвести максимальное количество дрожжей, которое после засева обеспечит оптимальную работу брожения». Важным разделом статьи является пункт о факторах влияющих на рост дрожжевых клеток.

В первую очередь это кислород, содержание которого «непосредственно коррелирует с быстрым ростом и увеличением массы дрожжей (числа клеток), аэрация в течение разведения дрожжей должна увеличить полное число дрожжевых клеток. Иными словами, ваши стартеры должны хорошо аэрироваться». Автор упоминает три метода, способствующих аэрации стартера: встряхивание, компрессор с камнем и санирующим фильтром, магнитная мешалка. По меньшей мере один из них должен быть взят на вооружение пивоваром. Предпочтение отдается последнему методу. В работе приведен следующий график.

Рисунок 3. Влияние аэрации на число клеток дрожжей «500 мл супер сусла фирмы BrewTek были засеяны 10 мл густой культуры дрожжей «суперстартер» BrewTek и инкубированы при температуре комнаты (24 °C) в течение двух дней. Культуры или встряхивались 3-6 раз в день, или аэрировались с системой BrewTek в течение нескольких минут (насколько позволяла пена) 3-6 раз в день, или непрерывно размешивались на магнитной мешалке. Концентрация дрожжей была определена BrewTek гемацитометром. Традиционный стартер (airlock) был взят из опубликованных Реем Данилсом в HBD *1746 материалов с использованием пакета Wyeast как посевного материала».

Результаты применения магнитной мешалки очень впечатляют. Однако на столбик с подписью «airlock» я бы не советовал обращать внимания. «Суперстартер» BrewTek вряд ли содержит менее 30 млрд клеток. При растворении в 500 мл это даст как минимум 60 млн клеток/мл. На диаграмме же изображено что-то около 25 млн/мл. Это не удивительно — данные взяты из другой работы, и, вероятно, сравнение не корректно в данном случае. Второй столбец также не вызывает полной уверенности по той же причине. Трудно судить отчего дрожжи не выросли совсем. Часто бывает, что часть клеток остается на дне в силу недостаточного перемешивания сусла с дрожжами. Может быть на результат повлияла подобная причина?! Два последних столбика диаграммы очень убедительны. Таким образом результаты использования магнитной мешалки все же трудно переоценить. Однако необходимо более четко представлять себе возможности этого прибора. Дело в том, что достижение концентрации клеток свыше 250 млн/мл (и тем более свыше 300 млн/мл) не всегда желательно.

Сколько требуется кислорода для роста дрожжей? «Штаммы эля обычно нуждаются в 8-12 частях на миллион (ppm), в то время как штаммы лагера требуют немного более высоких количеств (10-15 ppm)». Однако эти цифры вряд ли могут быть полезны для домашнего пивовара, обычно подобные измерения не делаются в домашних условиях. Более интересно следующее: «Инъекция кислорода через 2-х микронный камень, может фактически насытить сусло до 10-12 ppm растворенного кислорода, достигаемого в 5 галлонах в течение 60 секунд введения кислорода»!

Другой фактор — температура. «Большинство пивных дрожжей будет фактически расти и ферментировать до температуры 98 °F (37 °C). 86 °F (30 °C) — обычная температура для роста и рамножения лабораторных дрожжей, но это все еще слишком высоко для пивных дрожжей. Температура комнаты или 77°F (25 °С) — рекомендованная температура для того, чтобы размножить дрожжи для эля. 75°F (24 °С) градусов оптимальны для того, чтобы вырастить лагерные дрожжи, более высоких температур нужно избегать».

О разведении лагерных дрожжей необходимо сказать еще несколько слов. Эти слова «холодный стресс». Нельзя задавать стартер имеющий температуру 24 °С в сусло температурой 12 градусов. Это гарантировано приведет к неприятным последствиям — появлению петит мутантов и плохому, вялому брожению, появлению неприятных вкусов и ароматов. Скачки температуры вниз более чем на 10 градусов недопустимы. Как мы увидим ниже, на пивоваренных предприятиях разведение дрожжей происходит при температуре на 5-6 градусов выше температуры брожения. Таким образом, необходима акклиматизация стартера имеющего температуру выше 16-17 градусов. «Это может быть сделано, медленным понижением температуры стартера за день до внесения». Подробностей автор не приводит.

Для размножения дрожжей подходит обычное пивное сусло с начальной плотностью 1.040, которое «рекомендуется для использования во многих пивоваренных ситуациях». «У быстро растущих дрожжей в стартерах потребность в азоте выше, чем нормальное потребление. Таким образом, сусло стартера должно быть обогащено питательными веществами для дрожжей так, чтобы не было недостатка азота» (заметим в скобках, что другие авторы не всегда разделяют этого убеждения).

Резюме: «стартер должен быть составлен из сусла плотности 1.040, к которому добавлены питательные вещества на основе аминокислот (питательное вещество BrewTek или «Супер пища»). Все это должно быть аэрировано перед добавлением дрожжей. После добавления дрожжей, стартер должен храниться при комнатной температуре (~75 ° F, 24 ° С) и встряхиваться настолько часто насколько возможно (или еще лучше, постоянно размешиваться с помощью магнитной мешалки)».

Для разведения дрожжей понятие о стадиях роста является основополагающим. Raines-Casselman приводит следующий график.

Рисунок 4. Кривая роста для пивоваренных дрожжей. График демонстрирует типичные изменения количества клеток в жидкой среде при низкой концентрации. Показаны различные фазы роста. Время достижение стационарной фазы в действительности варьируется в зависимости от условий разведения, штамма дрожжей и начальной концентрации клеток

«Сначала идет фаза задержки. Это происходит в течение первых нескольких часов после внесения дрожжей. В это время нет никаких очевидных признаков брожения или роста. Дрожжи акклиматизируются к их новой окружающей среде. Если предыдущая среда (или стартер) была подобна этой новой, то акклиматизация произойдет быстро, и фаза задержки будет коротка. Главные изменения в это время происходят внутри дрожжей, они поглощают весь кислород в заторе, используя его, чтобы синтезировать все ферменты и другие метаболические приспособления, необходимые для роста и брожения, и запасают кислород в форме стеринов для более позднего использования. Эта стадия важна для брожения и должна произойти настолько быстро насколько возможно.

Вторая фаза — ускоряющегося роста, во время которой клетки дрожжей начинают расти и делиться. Признаки брожения также станут очевидными. Дрожжи начинают накопление сахара в форме гликогена для более позднего использования.

Третья фаза — экспоненциального роста, где воспроизводство дрожжей и метаболизм находятся в разгаре. Клетки делят каждые 90 — 180 минут и брожение начинается. В это время число клеток дрожжей может увеличиться 1000-кратно в течение 24 часов». В этой стадии количество клеток удваивается каждые три часа и быстро достигается максимально возможной концентрации. «Брожение становиться очень активным, и начинают формироваться завитки».

«Четвертая фаза – замедления роста. В это время кислород полностью исчерпан …

(трудно сказать, что автор имеет ввиду — внутриклеточные запасы или кислород в сусле, который, как известно, потребляется в первые 20 часов брожения, скорее всего первое)…

Брожение сусла переходит в стадию высоких завитков. … производится тепло и быстрое выделение CO2».

В финале «дрожжи входят в стационарную фазу. В это время сбраживаемые и питательные вещества полностью потребляются. Весь рост дрожжей останавливается, и они начинают оседать из раствора или флоккуировать. Стерин и гликоген, запасенный во время раннего роста, начинают разлагаться и использоваться, чтобы продолжить жизнедеятельность. Длительное пребывание в этой фазе (недели) может привести к автолизу или полному разрушению клетки».

Выше я специально опустил рекомендованные автором (на основе рисунка 4) временные интервалы. Это было сделано потому, что приведенный в статье график — просто некая типичная кривая. Как будет показано ниже на практике реальные кривые роста могут иметь различный наклон к оси времени, что может оказаться весьма существенным фактором для разведения. (Между прочим, в подписи к рисунку этот факт отражен, только применительно лишь ко времени достижения стационарной фазе).

«Рекомендуемые оптимальные нормы засева — 6-10 миллионов клеток/мл для эля и 10-15 миллионов клеток/мл для лагера. (Джордж Фикс рекомендует 10 миллионов клеток/мл для эля, 15 миллионов клеток/мл для лагера. Сусло более высокой плотности требует еще более высоких норм засева. Например, в сусло эля плотностью 1.096 должны быть засеяны 14-20 миллиона клеток/мл».

( Только в этом случае, как считает Raines-Casselman, дрожжи быстро оказываются на логарифмическом участке роста, в соответствии, опять же, с рисунком 4. Такая аргументация подкупает своей простотой, но не учитывает того простого обстоятельства, что приведенная на графике зависимость не имеет «обратной силы». То есть если в среде имеется, например, 10 млн/мл клеток, это еще не означает, что дрожжи находятся в логарифмической фазе роста).

Далее читаем, что в случае недосева «Дрожжи проведут намного больше времени, пытаясь расти к адекватным количествам. Во время этого удлиненного периода роста дрожжи имеют тенденцию выделять больше сложных эфиров и сивушных спиртов. Кроме того, у них, возможно, не окажется достаточного числа, чтобы соответственно усвоить весь способный к брожению сахар. Таким образом то, что Вы получите, будет пивом с off flavors (такими как эфиры, сивушные спирты, диацетил, ацетальдегид) и высокой конечной плотностью. Таким образом, всегда важно сделать стартер и сделать его достаточно большим. Помните, что Вы хотите, чтобы дрожжи потратили большую часть своей энергии, делая алкоголь, а не младенцев в ферментер!!»

(Подобное обоснование существующих норм засева, хотя имеет яркую эмоциональную окраску, представляется, не вполне убедительным, и как будет показано ниже, также не вполне корректно. В частности, низкая норма засева приводит ни к росту содержания эфиров, а наоборот, к снижению).

Когда питательные вещества сусла начнут стремительно сокращаться дрожжи переходят в стадию замедленного роста и в конечном итоге начнут употреблять запасенные питательные вещества. Вот этого ни в коем случае нельзя допускать, потому что для последующего брожения требуются здоровые активные клетки, полные жизненных сил. Основным условием разведения является обеспечение дрожжей питательными веществами в достаточном для их массы количестве. Чаще всего бродящее тело будущего стартера просто переливается в больший по объему сосуд со свежим суслом. Подобные методики были придуманы для разведение дрожжей из одной маленькой колонии, а не из пробирки или пакета с большим количеством культуры, хотя и в этом случае они находят свое применение.

Вопрос первый: «какой величины стартер, Вы должны сделать, чтобы попасть в норму засева»? По мнению автора статьи, ответ можно легко получить используя рисунок 3. Однако необходимо принимать во внимание те оговорки, которые были сделаны выше. Самый оптимальный по объему сусла стартер дает использование магнитной мешалки. Считается, что в хорошо аэрируемом сусле дрожжи без каких-либо механических побуждений в виде перемешивания способны быстро вырасти до объема около 100 млн/мл (при отсутствии аэрации, концентрация оказывается раза в два три меньше, о причинах будет сказано ниже).

Для того чтобы получить указанные выше 300 млрд клеток для 30 литров сусла эля, нужен стартер объемом 3 литра. Для лагера потребуется огромный 6-литровый стартер. Магнитная мешалка позволяет уменьшить объем раза в три, для комнатных температур разведения. Таким образом стартер для эля вполне может поместиться в посудину объемом 1 л (на практике целесообразно использовать несколько больший объем, чтобы пена не покидала пределы сосуда). С лагером сложнее — добиться такого результата даже с магнитной мешалкой не всегда удается. В данном случае объем стартера будет зависеть от температуры разведения и прочих условий, в частности, аэрации.

«Следующая проблема – как долго будет делаться большой стартер, и как поступаю я. Как только у нас есть насыщенная культура (10 мл), производство должно занять только несколько дней, для достижения необходимых объемов. Внимательное изучении рисунка 4 указывает, что дрожжи не должны быть разбавлены больше чем 200 раз к предыдущему объему. Иными словами 10 мл не должны быть увеличены более чем до 2-х литров. Объяснение этого просто. Во время разведения важно держать дрожжи, растущими по экспоненте (рисунок 4, фаза III). Слишком сильное растворение дрожжей замедлит их рост и даст бактериям шанс настигнуть культуру. Так как бактерии могут расти в 6 раз быстрее, чем дрожжи (среднее время удвоения для бактерии составляет 20 минут)! Важно держать дрожжи, в фазе быстрого роста. Если требуются больше чем 1 или 2 литра стартера, лучше делать больше шагов. В большинстве случаев хорошо изготовить промежуточный стартер на 500 мл и после 1-2 дней довести его до 1-2 галлонов. В каждом случае дрожжи должны достигнуть фазы насыщенности через 24-48 часов. Рисунок 5 обрисовывает в общих чертах две различных стратегии разведения».

Рисунок 5. Разведение дрожжей. Изображены различные шаги, процесса создания достаточного числа дрожжей, чтобы сделать засев. Метод магнитной мешалки (вверху) показан совместно с методом периодического встряхивания (внизу). Пробирку на 10 мл можно заменить пакетом жидких дрожжей (~50 мл). Каждый рост должен происходит в течение, по крайней мере, одного дня, получается полных 3 дня при температуре комнаты (75 °F, 24 °С).

Если автор подразумевает под 10 мл пробиркой — сосуд с 10 мл густой культуры, то можно поспорить о необходимости трех дней при 24 °С, обычно достаточно одного (с утра до вечера). Многое, конечно, зависит от состояния дрожжей.

«Хотя 100-кратное или большее разбавление кажутся разумными для разведения дрожжей, (о чрезмерном разбавлении стартеров будет сказано ниже — этого делать не нужно) большинство пивоваренных заводов (или, по крайней мере, как это преподается пивоваренными школами), выступают за меньшие растворения. Институт Siebel рекомендует, чтобы дрожжи были разбавлены 8-и кратно, британские пивоваренные школы рекомендуют 10-кратные, а немецкие пивоваренные школы 4-кратные разбавления. Почему такие маленькие приращения? Хороший ответ находится в продуктивности брожения. Большое разбавление, возможно, изменяет эффективность метаболизма способного к брожению сахара в сусле. Затронутыми являются сахара, которые сбраживаются последними, прежде всего мальтоза и maltotriose. Таким образом, дрожжи, которые размножены с большим разбавлением, будут характеризоваться более низким ослаблением и более сладким финалом» (есть и другое объяснение, не менее значимое в плане размножения дрожжей, см. ниже).

Кроме этого, необходимо помнить о возможности контаминации. Чем больше бродящего сусла добавляется к свежему, тем быстрее создаются антимикробные условия в стартере. Минимальная порция свежего сусла определяется также частотой разбавления стартера. Число дрожжей удваивается каждые три-четыре часа (примерно). Через 12 часов роста клеток будет в восемь раз больше, следовательно потребуется соответствующее количество свежего сусла для их питания и нормального развития (8-кратное разбавление).